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IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)는 β-갈락토시다제 기질의 유사체이며 유도성이 높습니다.IPTG의 유도 하에서 유도자는 억제 단백질과 복합체를 형성할 수 있으므로 억제 단백질의 형태가 변경되어 표적 유전자와 결합할 수 없으며 표적 유전자가 효율적으로 발현됩니다.그렇다면 실험 중에 IPTG의 농도를 어떻게 결정해야 할까요?크면 클수록 좋은가요?
먼저 IPTG 유도 원리를 이해해 보자. 대장균의 유당 오페론(요소)에는 각각 β-갈락토시다아제, 퍼미아제 및 아세틸트랜스퍼라아제를 암호화하는 Z, Y 및 A의 세 가지 구조 유전자가 포함되어 있다.lacZ는 유당을 포도당과 갈락토오스 또는 알로-락토오스로 가수분해합니다.lacY는 환경의 유당이 세포막을 통과하여 세포로 들어가도록 합니다.lacA는 아세틸-CoA에서 β-갈락토사이드로 아세틸기를 전달하며, 이는 독성 효과를 제거하는 것과 관련됩니다.또한 작동 시퀀스 O, 시작 시퀀스 P 및 조절 유전자 I가 있습니다. I 유전자 코드는 작동자 시퀀스의 위치 O에 결합할 수 있는 억제 단백질이므로 오페론(meta)이 억제되고 껐다.개시 서열 P의 업스트림에 이화 작용 유전자 활성인자 단백질-CAP 결합 부위에 대한 결합 부위도 있다. P 서열, O 서열 및 CAP 결합 부위는 함께 lac 오페론의 조절 영역을 구성한다.세 가지 효소의 코딩 유전자는 유전자 산물의 조정된 발현을 달성하기 위해 동일한 조절 영역에 의해 조절됩니다.

유당이 없으면 lac 오페론(메타)은 억제 상태에 있습니다.이때, PI 프로모터 서열의 조절 하에 있는 I 서열이 발현하는 lac repressor가 O 서열에 결합하여 RNA 중합효소가 P 서열에 결합하는 것을 방해하여 전사 개시를 억제하고;유당이 존재할 때 lac 오페론(메타)이 유도될 수 있습니다. 이 오페론(메타) 시스템에서 실제 유도제는 유당 자체가 아닙니다.유당은 세포에 들어가고 β-갈락토시다제에 의해 촉매되어 알로락토오스로 전환됩니다.후자는 유도 분자로서 억제 단백질에 결합하고 단백질 구조를 변경하여 억제 단백질을 O 서열 및 전사로부터 분리시킵니다.아이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)는 알로락토오스와 같은 효과가 있습니다.매우 강력한 유도제로서 박테리아에 의해 대사되지 않고 매우 안정적이어서 실험실에서 널리 사용됩니다.

IPTG의 최적 농도를 결정하는 방법은 무엇입니까?대장균을 예로 들어 보겠습니다.
양성 재조합 pGEX(CGRP/msCT)를 포함하는 E. coli BL21 유전자 조작 균주를 50μg·mL-1 Amp가 포함된 LB 액체 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 배양했습니다.상기 배양액을 50μg·mL-1 Amp를 함유한 50mL 신선한 LB액체배지 10병에 1:100의 비율로 접종하여 증식배양하고 OD600값이 0.6~0.8이 될 때 IPTG를 최종농도까지 첨가하였다.0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1이다.같은 온도, 같은 시간에 유도한 후 균액 1mL를 취하여 원심분리하여 균체를 채취하여 SDS-PAGE를 실시하여 IPTG의 농도에 따른 단백질 발현의 영향을 분석한 후, 단백질 발현이 가장 큰 IPTG 농도를 선택합니다.
실험 후, IPTG의 농도가 가능한 한 크지 않다는 것을 알게 될 것입니다.이것은 IPTG가 박테리아에 특정 독성을 가지고 있기 때문입니다.농도를 초과하면 세포도 죽습니다.일반적으로 우리는 세포에서 더 많은 수용성 단백질이 발현될수록 더 좋기를 희망하지만 많은 경우에 IPTG의 농도가 너무 높으면 많은 양의 포함이 형성될 것입니다.체질이지만 수용성 단백질의 양은 감소하였다.따라서 가장 적합한 IPTG 농도는 클수록 좋은 것이 아니라 농도가 낮을수록 좋은 경우가 많습니다.
유전자 조작 균주의 유도 및 배양의 목적은 목적 단백질의 수율을 높이고 비용을 줄이는 것입니다.표적 유전자의 발현은 균주 자체의 인자와 발현 플라스미드뿐만 아니라 유도물질의 농도, 유도온도, 유도시간 등의 기타 외부조건에 의해서도 영향을 받는다.따라서 일반적으로 알려지지 않은 단백질을 발현 및 정제하기 전에 적절한 조건을 선택하고 최상의 실험 결과를 얻기 위해서는 유도 시간, 온도 및 IPTG 농도를 연구하는 것이 가장 좋습니다.