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미생물 숙주의 신진대사를 이해하는 것은 생산 효율을 좌우하기 때문에 전체 세포 기반 생체 촉매 공정의 개발 및 최적화에 필수적입니다.이것은 숙주에서 내인성인 보조인자/공기질 재생 능력 때문에 대사 활성 세포가 사용되는 산화환원 생물촉매에 특히 해당됩니다.재조합 대장균은 P4H(proline-4-hydroxylase), 자유 L-프롤린을 공동기질로 a-케토글루타레이트(a-KG)와 함께 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린으로 하이드록실화하는 것을 촉매하는 디옥시게나제인 프롤린-4-하이드록실라제(P4H)를 과잉 생산하는 데 사용되었습니다.이 전체 세포 생체 촉매에서 중앙 탄소 대사는 탄소 대사 및 대사 활동에 P4H 생체 촉매 성능을 직접 연결하는 필수 공동 기질 a-KG를 제공합니다.대사 공학 및 (13)C-대사 플럭스 분석((13)C-MFA)과 같은 실험 및 전산 생물학 도구를 모두 적용하여 전체 세포 생체 촉매의 생리적, 대사 및 생체 에너지학적 반응을 조사하고 정량적으로 설명했습니다. 프롤린 탈수소효소를 암호화하는 putA 유전자를 삭제하여 프롤린 분해 결핍 대장균 균주를 구축했습니다.이 돌연변이 균주를 사용한 전체 세포 생체변환은 양적 프롤린 하이드록실화뿐만 아니라 야생형에 비해 특정 트랜스-4-L-하이드록시프롤린(hyp) 형성 속도를 두 배로 높였습니다.돌연변이 균주의 중심 대사를 통한 탄소 플럭스의 분석은 P4H 활성에 대한 증가된 α-KG 요구가 α-KG 생성 플럭스를 향상시키지 않았으며, 이는 연구된 조건 하에서 엄격하게 조절된 TCA 사이클 작동을 나타냅니다.야생형 균주에서 P4H 합성 및 촉매작용은 바이오매스 수율을 감소시켰다.흥미롭게도, ΔputA 균주는 TCA 활성을 증가시키는 대신 비교적 낮은 포도당 흡수 속도에서 유지 에너지 요구를 줄임으로써 관련 ATP 및 NADH 손실을 추가로 보상했습니다. 재조합 대장균 BL21(DE3)(pLysS)에서 putA 녹아웃은 생체 변환 수율 측면에서 뿐만 아니라 생체 변환 및 프롤린 섭취율과 에너지원에 대한 hyp 수율 측면에서 생산적인 P4H 촉매 작용에 유망합니다.결과는 putA 녹아웃 시 공동기질 a-KG를 통한 프롤린 하이드록실화에 대한 TCA 사이클의 커플링이 α-KG 의존적 생체변환의 효율성을 더욱 향상시키기 위한 핵심 요소 제약 및 목표가 됨을 나타냅니다.